LightNing® EagI内切酶组成

特性和用法

LightNing® EagI内切酶，可在5~15 min内完成反应

u建议反应条件

1× CutOne®缓冲液；

37℃温育；

参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

u失活条件

80℃温育20 min。

u甲基化敏感性

对于被 CpG 甲基化的 DNA，剪切可能受阻。

u储运条件

-20℃

相关问答

Q:为什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

A:一些酶在反应过程中需要HSA的参与，我们在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反应中额外添加组分，使得酶切反应更加便捷。

Q:HSA的添加对于雷霆系列限制性内切酶的功能会产生什么样的影响？

A:在我们的测试中未曾发现HSA对于雷霆系列限制性内切酶的功能有任何影响。在有些情况下，对于部分的酶切反应有促进作用。

Q:我需要严格遵守5~15 min的酶切时间吗？能够延长反应时间吗？

A:雷霆系列限制性内切酶经过改造可以将酶切时间缩短至5~15 min。同样也消除了限制性内切酶的星活性（长时间反应造成的非特异性消化），在说明书中告知的星活性出现的时间范围内可以适当延长反应时间。

Q:我什么时候应当考虑星活性对于酶切反应的影响？

A:如果额外的酶切条带对于实验结果会产生影响时我们应当考虑星活性对于酶切反应的影响。例如：进行基因型、突变型分析或克隆时我们应当避免星活性的产生。避免星活性的有效方法：适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的5%）；不进行超长时间孵育（过夜消化极易产生星活性）。

Q:有哪些关键因素会导致星活性？

A:长时间孵育、过量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、较小的反应体系等因素都会导致星活性的产生。

Q:未经纯化的PCR产物直接酶切要怎样设定体系？

A:反应体系推荐由这些内容组成：10 μl PCR产物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相应的限制性内切酶、ddH2O补齐到30 μl。酶的用量根据PCR产物的浓度而定，只加入2 μl反应缓冲液的原因是PCR反应中存在对应的盐离子和金属离子，适当减少反应缓冲液的用量以保证最终反应体系中的环境适宜限制性内切酶发挥功能。

Q:限制性内切酶简并性识别位点一定是回文的吗？

A:大多数二型限制性内切酶的识别序列是回文的，而且是特定的碱基序列。然而有些限制性内切酶具有简并性识别位点，也就是说识别位点中有一个或以上的碱基对是非特异的（例如：BsrfI识别5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。对于这样的具有简并性识别位点的限制性内切酶，只要是符合要求的序列皆能被识别并且被正确地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中两个并不是回文的，仍然能被BsrFI识别并且切割）。